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l'invention décrit de nouveaux réactifs dont la fluorescence augmente en présence de protéases spécifiques. les réactifs comprennent une ossature peptidique pliée de manière caractéristique dont chaque extrémité est conjuguée à un fluorogène. lorsque le peptide plié est clivé, par digestion avec une protéase, les fluorogènes produisent un signal fluorescent de haute intensité à une longueur d'ondes visibles. ces indicateurs de protéase sont particulièrement bien appropriés à la détection de l'activité de protéase dans des échantillons biologiques, en particulier dans des sections de tissus gelés, en raison de leur signal de forte fluorescence dans les longueurs d'ondes visibles. la figure 1 illustre une analyse hplc de l'indicateur de protéase d-norfes-a comprenant 5'-carboxytétraméthylrhodamine (c2211) en tant que fluorogène donneur et rhodamine x acétamide (r492) en tant que fluorogène accepteur, la figure 1 (a) illustrant hplc de la molécule indicateur intacte avant l'addition d'élastase; la figure 1 (b) illustre hplc où les deux fluorogènes absorbent après addition d'élastase et la figure 1 (c) illustre hplc après addition d'élastase lorsque rhodamine x acétamide (r492) absorbent au maximum. cette invention décrit également les procédés de détection de l'activité de protéase in situ dans des sections gelées.
the present invention provides for novel reagents whose fluorescence increases in the presence of specific proteases. the reagents comprise a characteristically folded peptide backbone each end of which is conjugated to a fluorophore. when the folded peptide is cleaved, as by digestion with a protease, the fluorophores provide a high intensity fluorescent signal at a visible wavelength. these protease indicators are particularly well suited for detection of protease activity in biological samples, in particular in frozen tissue sections, because of their high fluorescence signal in the visible wavelengths. figure 1 shows an hplc analysis of the d-norfes-a protease indicator comprising 5'-carboxytetramethylrhodamine (c2211) as a donor fluorophore and rhodamine x acetamide (r492) as an acceptor fluorophore so that figure 1 (a) illustrates hplc of the intact indicator molecule before the addition of elastase; figure 1 (b) illustrates hplc where both fluorophores absorb after the addition of elastase and figure 1(c) illustrates hplc after the addition of elastase where rhodamine x acetamide (r492) absorbs maximally. this invention also provides for methods of detecting protease activity in situ in frozen sections.