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detección de e2 las células fueron transfectadas con pcmve2 y fixed 24 horas después de la transfección como se describió anteriormente. después de lavados en pbs, las células fueron permeabilizadas en 0,5% np40/pbs/10% de sacarosa durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego se lavan tres veces con 1% fcs / pbs. los cubreobjetos se incubaron en el mab tvg261 durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavan en el 1% fcs / pbs y se incubaron con un anticuerpo anti-ratón conjugado, ya sea con texas red o con fitc (sigma). después de los lavados siguientes en 1% fcs / pbs, los cubreobjetos fueron montados en af1 y analizados como el anterior. visualización del aparato de golgi el ag se visualizo por tinción con bodipy-tr- ceramida. las células fueron cultivadas hasta un 80% confluencia en cubreobjetos en pocillos separados. después de la eliminación del medio, las celulas se lavaron dos veces con dmem libre de suero, hepes 25 mm (dmem-h) y se incubaron en 200 ml de 5 mm bodipy-tr- ceramida, la cual se localiza en el ag, en dmem-h por 30 min a 48c. las células fueron lavadas con dmem-h por 30 minutos a 37.8c. después de eliminar el medio y el lavado con pbs, las células frescas se fijaron con paraformaldehido 3% (pfa) durante 20 minutos a temperatura ambiente y se montaron con vectashield (vector laboratories inc, reino unido).
detection of e2 cells were transfected with pcmve2 and ®xed 24 h after transfection as described above. following washes in pbs, the cells were permeabilized in 0.5% np40/pbs/10% sucrose for 10 min at room temperature and then washed three times with 1% fcs/pbs. the coverslips were incubated in mab tvg261 for 1 h at room temperature, washed in 1% fcs/ pbs and then incubated with an anti-mouse antibody conjugated either with texas red or with fitc (sigma). following further washes in 1% fcs/pbs, coverslips were mounted in af1 and analysed as above. visualization of golgi apparatus the ga was visualized by staining with bodipy-tr- ceramide. cells were grown until 80% con¯uent in single well chamber slides. after removal of medium cells were washed twice with serum free dmem, 25 mm hepes (dmem-h) and incubated in 200 ml of 5 mm bodipy-tr- ceramide, which localizes to the ga, in dmem-h for 30 min at 48c. cells were then washed with dmem-h for 30 min at 378c. after removal of the medium and washing with pbs, cells were ®xed with fresh 3% paraformaldehyde (pfa) for 20 min at room temperature and mounted with vectashield (vector laboratories inc, uk).